堪萨斯州立大学柏贵华课题组Fhb1简易诊断标记的开发及其应用

      小麦赤霉病（FHB）是世界性的重要小麦病害，选育和种植抗病品种是降低其危害的有效途径。由于FHB表型鉴定繁琐、周期长且易受环境影响，使得分子标记辅助选择在FHB抗性育种中显得尤为重要。堪萨斯州立大学柏贵华教授课题组成功开发了Fhb1基因的诊断性标记（其实这个标记早已在文章发表之前在国内使用很久了）。近日，题为“Development and validation of diagnostic markers for Fhb1 region, a major QTL for Fusarium head blight resistance in wheat”发表在《Theoretical and Applied Genetics》期刊上。

       Fhb1是迄今发现的效应最大、最稳定，也是唯一被广泛应用于全球小麦赤霉病抗性育种的基因（QTL）。自上世纪90年代Fhb1被定位于小麦的3BS染色体上以来，与之连锁的侧翼标记（Flanking markers）Xgwm533和Xgwm493（SSR）就被用于辅助选择育种。然而，由于这两个标记与Fhb1距离较远（>10cM），非特异扩增较多，抗（Fhb1-R）\感（Fhb1-S）间片段差异小，检测通量低且繁琐（PAGE胶或毛细管电泳），限制了该标记的广泛应用。此后，在对Fhb1进行精细定位研究的基础上，开发了与之紧密连锁的标记Sts138，Sts256 和Umn10等。然而这些标记在检测方法上同Xgwm533 和Xgwm493并无区别。其中，由于Umn10可以很好的区分欧、美品种Fhb1-S和Fhb1-R，被作为Fhb1的近诊断标记（Near diagnostic marker）应用最广。然而，越来越多假阳性的报道和Umn10对检测仪器和实验条件的严苛要求（大多品种间抗/感品只有3bp的差异）限制了该标记的应用。虽然目前关于Fhb1抗性基因克隆的报道仍存争议，但开发与之紧密连锁、简易、低成本且“育种家应用友好”型（breeder-use-friendly）的（诊断性）标记，对其在小麦赤霉病抗性标记辅助育种中的应用显得尤为重要。

       在对Fhb1进行图位克隆研究的基础上，对Fhb1精细定位区间的单倍型分析（Haplotype analysis）发现（我们实际用了18个标记，但在reviewer的建议下，文章中只保留了4个标记的Hap.分析）。在所用的多态性标记中，只有位于该区域内编码一个功能未知的组氨酸富集的钙结合蛋白（TaHRC）基因内部的一个大的插入/缺失（In/Del）可将携带Fhb1-R和Fhb1-S位点的种质区分开来。对TaHRC测序发现，所有携带Fhb1-R位点的品种具有完全相同的序列，尽管这些种质并不存在明显的亲缘关系。相反，携带Fhb1-S位点的品种中TaHRC的序列差异较大。为了开发可适用于全球Fhb1辅助选择育种的标记，我们选择了TaHRC在抗感种质间的保守序列并开发了基因特异性标记，TaHRC-GSM。该标记为小麦3B染色体特异扩增，呈共显性。在携带Fhb1-R的种质中扩增获得的片段为1293bp，而在携带Fhb1-S的种质中扩增得到1916-2045bp不等的片段。TaHRC-GSM检测流程简易、成本低且对实验室装备及检测人员要求不高。PCR扩增后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳20-30min即可完成基因型检测流程，是育种家使用友好型标记。

       KASP是根据PCR扩增后荧光信号来区分基因型的标记类型，具有通量高、快速、简易等特点，已成为检测SNP的主要标记类型。为适应不同实验室的需求，根据KASP的工作原理，我们开发了TaHRC的KASP标记，TaHRC-Kasp。基于TaHRC在携带Fhb1-R和Fhb1-S位点种质中的保守序列，分别设计了TaHRC-R及TaHRC-S的正向序列及其共有的反向引物序列，该标记检测的结果与TaHRC-GSM完全一致。

      对TaHRC-GSM和TaHRC-Kasp标记在全球自然群体及分离群体进行验证发现，该标记可作为Fhb1的诊断性标记用于全球小麦赤霉病抗性分子标记辅助育种。目前USDA的四个Genotyping Center已经将该标记用于日常Fhb1辅助选择育种，CIMMTY, 加拿大，德国及中国农科院(张宏军等，2018， 作物学报)等单位在实际应用中也得到了进一步的验证。

      目前，通过QTL 定位（Quantitative trait loci mapping）和关联分析（Association analysis）等方法已定位了大量与产量、品质、抗性等育种目标性状连锁的标记。然而，由于大多标记存在检测方法繁琐、效率低、成本高、与目标性连锁不紧密等问题，使得已发表的多数研究结果仍停留在“文章”层面，未能“落地”而用于辅助育种。小麦赤霉病抗性主效QTL—Fhb1，从定位、基因克隆到应用的研究历程为其他重要性状标记辅助选择育种提供了重要参考，也为我们从事农业基础研究人员的成果从论文走向田间提出更高要求。

       再次感谢小麦研究联盟的邀请和努力的工作！如果哪个老师和同学在使用该标记或遇到其他标记开发上的技术上的问题可以e-mail 联系我（suzhenqi80@163.com）或柏贵华老师（gbai@ksu.edu）,我们随时交流沟通，希望能为小麦分子育种提供一些帮助。

柏贵华老师简介：柏贵华是美国农业部分子遗传学家，堪萨斯州立大学遗传育种学教授，也是美国小谷物基因分型实验室主任。其实验室免费为美国硬粒冬小麦主产区的育种家提供分子标记服务；研究方向主要集中在构建高通量基因分型技术平台、开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记、精细定位及克隆与生物/非生物逆境有关的抗性基因及产量性状基因尤其是抗赤霉病基因Fhb的克隆。目前该实验室已定位多个抗病位点如耐铝中毒、抗穗发芽、抗三锈（条锈、叶锈、秆锈）及白粉病及一些抗虫等性状。该实验室共参与培育品种超过50个。在抗赤霉病研究方面，首次报道在中国抗源中携带效应较大的QTL且构建抗赤霉病评价体系作为金标准广泛在全世界应用。

PS: 为了怕遗漏，小编特意将英文介绍附在下面，英语好的伙伴可以看一看。

Dr. Guihua Bai is a Research Molecular Geneticist in US Department of Agroiculture and Professor in Genetics and Breeding in Kansas State University. He is also the Director of USDA Central Small Grain Genotyping lab located in Manhattan, KS USA. Dr. Bai’sLab has both research and service components. His lab provides free marker service to breeders in the US hard winter wheat region. His research focuses on developing and implementing high-throughput genotyping technologies and tightly linked markers to agronomically important traits for marker-assisted breeding,fine mapping and cloning important genes or QTLs for resistance to biotic and abiotic stresses and yield components and developing locally adapted FHB resistant germplasm using marker-assisted backcross. His lab has mapped numerous QTLs for wheat resistance to aluminum toxicity, preharvest sprouting,three rusts, powdery mildew, Hessian Fly, wheat curl mite, tan spot, and forwheat yield components. His lab has cloned a gene for resistance to wheatpreharvest sprouting and for wheat FHB resistance (Fhb1), and contributed tocloning severalgenes in Medicago truncatulaand sorghum bicolor. His lab co-released more than 50 hard winter wheatcultivars and germplasm with regional breeders. For FHB research, his lab firstreported the major effect QTL for FHB resistance in Chinese sources, firstestablished FHB quantitative scoring method for genetic study, which has beenused as gold standard for quantification of FHB resistance worldwide, andrecently found that a deletion mutation in TaHRC is responsible for Fhb1 resistance in Ning7840 and many other Chinese germplasm.