佐治亚理工学院夏幼南AdvancedMaterials矿物质含量梯度渐变反蛋白石支架用于干细胞成骨分化的空间调控

撰稿 | 淡淡的天空            编辑 | 化学加

导读

近日，佐治亚理工学院夏幼南教授课题组（通讯作者）在国际顶级期刊 Advanced Materials上成功发表 “Inverse Opal Scaffolds with Gradations in Mineral Content for Spatial Control of Osteogenesis”的论文。论文第一作者为朱春雷博士、仇吉川和Suphannee Pongkitwitoon博士。该研究描述了矿物质含量梯度渐变反蛋白石支架的设计和制备，并利用其实现了干细胞成骨分化的空间调控。

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【引言】

肌肉骨骼系统依靠许多界面来传递矿化组织和非矿化组织之间的负荷，包括软骨与骨，肌腱与骨和韧带与骨之间的界面。这些组织界面通常表现出矿物质含量、组织结构、细胞表型和胞外基质的梯度渐变，它们对于组织间的功能性整合、应力削减以及负荷传递极其重要。由于组织界面在受损后无法再生，通常需要手术的方式将软组织重新连接到骨上以实现关节功能的恢复。然而手术介入通常不能有效创建功能性过渡组织，因此大多数修复治疗并不能得到理想的临床效果。

近年来，界面组织工程已经成为修复骨科组织界面的一种极其有前景的方法。该方法利用接种有细胞的3D支架在“软组织”和“硬组织”重建稳固的界面。为了促进功能性组织界面的再生，在设计和制备这类支架时应当考虑几个重要的原则。首先，支架应具备多孔结构以促进细胞的浸润和增殖。其次，支架应提供空间渐变的生化和/或机械诱因以在组织间产生平滑的过渡。第三，支架应当以连贯的整体结构呈现，以确保再生组织间的无缝衔接。虽然曾有相关研究模拟骨科组织界面中的矿物质梯度，但它们大多集中在制备多层支架上，而并非结构连贯的3D支架。多层支架的潜在问题在于相邻层之间的非平滑边界，这对于光滑组织界面的再生非常不利。此外，这些多层支架的孔结构不具有高度均一性，导致单个支架内部机械性能的不均一以及不同批次支架间制备的不可重复性。支架结构性能的不均一会直接影响局部组织的再生能力，因而极大地限制了它们在组织工程中的应用。反蛋白石支架具有周期性高度有序的孔结构，已广泛用于骨、软骨和骨-软骨的修复与再生。由于其均匀的孔隙和相互连接的孔腔以及不同批次间物理性质的高度均一性，它们正成为一类理想的仿生材料。然而，利用这类支架构建细胞表型梯度渐变的研究却没有被报道过。因此，该研究将重点放在了制备具有羟基磷灰石（HAp）矿物质含量梯度渐变的反蛋白石支架上，并利用其实现对脂肪间充质干细胞（ASC）成骨分化的空间调控。大量研究表明，干细胞的分化可以通过基底组成和机械应力来调控，因此我们预期ASC的成骨分化应遵循矿物质的梯度变化而变化。据我们所知，这项研究首次报道了矿物质含量梯度渐变的反蛋白石骨架并用其实现成骨分化的空间调控，我们相信这类3D支架将为组织工程和再生医学的发展提供一种新型的工具和手段。

【成果简介】

    近日，佐治亚理工学院夏幼南教授课题组（通讯作者）在国际顶级期刊 Advanced Materials上成功发表 “Inverse Opal Scaffolds with Gradations in Mineral Content for Spatial Control of Osteogenesis”的论文。论文第一作者为朱春雷博士、仇吉川和Suphannee Pongkitwitoon博士。该研究描述了矿物质含量梯度渐变反蛋白石支架的设计和制备，并利用其实现了干细胞成骨分化的空间调控。矿物质含量的梯度变化通过HAp纳米颗粒在密堆积明胶微球阵列中的限制扩散所建立。矿物质梯度渐变支架具有均一的孔隙和相互连接的窗口，可以促进养分和代谢废物的有效运输，从而确保高的细胞存活率。矿物质含量的梯度渐变为ASC成骨分化的空间调控提供了生化和机械诱因，有望用于矿化组织和非矿化组织间过渡界面的功能性重建。

【全文解析】

方案一 通过在明胶微球的密堆积阵列中沉淀HAp纳米颗粒以在PLGA反蛋白石支架中产生矿物质梯度的示意图。

图1. 在PLGA反蛋白石支架中HAp纳米颗粒分布的表征。A）SEM俯视图像。B）沿垂直方向钙含量的EDX表征（n = 3）。层号代表去除模板后的孔层（见方案1）。C-F）HAp梯度变化PLGA支架（C，D）及其矢状切面（E，F）的Micro-CT图像。

图2. HAp梯度变化PLGA支架的局部杨氏模量分析。沿着矿物质梯度的四个位置测量杨氏模量（位置编号1和4分别代表高度矿化和非矿化区域）（n = 6）。 显著性差异由条棒上方的横线表示（p <0.05）。

图3. A-C）培养7（A），14（B）和21天（C）后，在HAp梯度变化PLGA支架中ASCs细胞存活性分析。DAPI以绿色以突显ASC的位置。比例尺：200微米。D）由（A）-（C）中所示图像统计得到的细胞存活率（n = 3）。

图4. A-C）培养7（A），14（B）和21天（C）后，接种于HAp梯度变化PLGA支架中ASC的ALP染色（红色）分析。白色箭头表示钙结节。比例尺：100微米。D-F）在7（D），14（E）和21天（F）培养后沿垂直方向ALP的MPI分析（n = 3）。显著性差异由条棒上方的横线表示（p <0.05）。

图5. A）14和B）21天培养后，接种于HAp梯度变化PLGA支架中ASC在位置1，2，3和4处的OCN染色分析。细胞核用DAPI染色并显示为蓝色，OCN显示为绿色。比例尺：50微米。C，D）对应于图（A）和（B）所示图像OCN的MPI分析（n = 3）。显著性差异由条棒上方的横线表示（p <0.05）。

图6 在A）0和B）21天培养后，接种ASC的HAp梯度变化PLGA支架上茜素红S暗场染色图像。白色箭头表示钙结节。比例尺：100微米。C）对应于图（A）和（B）的MPI分析（n = 3）。显著性差异由条棒上方的横线表示（p <0.05）。

【总结与展望】

研究人员发展了一种简单通用的方法用于矿物质含量梯度渐变反蛋白石支架的制备，并实现了干细胞成骨分化的空间调控。接种的ASC对支架中梯度变化的生化和机械诱因表现出了逐级渐变的响应。该生物相容支架为养分和代谢废物的有效运输提供了合适的微环境，使得ASC在接种和培养过程中维持了高的细胞存活率。由于HAp具有骨传导性和骨诱导性，因此早期（ALP）和晚期（OCN）骨标志物的表达与局部矿物质含量呈正相关变化。细胞表型在支架上的梯度变化模拟了结缔组织与骨界面中的细胞分布，因此该策略为同时引入矿物质含量和细胞表型的梯度渐变提供了有效的方案。除此之外，该支架还可以与各类具有生物活性的分子（如生长因子）和/或纳米结构（如取向纳米纤维）结合，进一步促进邻近组织间的无缝衔接，这对于骨组织界面的再生与重建具有十分重要的意义。

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